GILSON PIPETMAX 268 Laborategiko Likidoen Manipulazio Plataforma Automatizatua
ONURAK
- PIPETMAX® 268-ren automatizazioak prozesua errazten du, PCR purifikazioa fidagarriagoa eta erreproduzigarriagoa bihurtuz.
- Bereizgailu magnetiko pertsonalizatuak 96 segundo arteko arazketa azkarra ahalbidetzen duamples exekuzio bakarrean, eraginkortasuna handituz.
- Protokolo automatizatua malgua eta pertsonalizagarria da, erabiltzaileei aldagaiak doitzeko aukera emanez lan-fluxu eta aplikazio desberdinetara egokitzeko.
JARRAITUTAKO GAIAK
- PCR bidezko purifikazioa askotan neketsua eta teknikoki erronka handikoa da, eskuzko ahalegina eta zehaztasuna eskatzen dituena.
- Eskuzko manipulazioaren mugakamperrendimendu txikia, hainbat s prozesatzea denbora asko eskatzen duenaamples.
- Protokoloek malgutasun falta izan dezakete, bolumena, garbiketak edo inkubazio denborak bezalako parametroak doitzeko gaitasun mugatua izanik.
SARRERA
- PCRren purifikazioa. ampLikonak hainbat aplikaziotarako beharrezkoak dira, besteak beste, Sanger eta hurrengo belaunaldiko sekuentziazioa (NGS), genotipatzea, nukleotido bakarreko polimorfismoa (SNP) detektatzea, klonazioa, zatien analisia eta primerren ibiltzea. Garbiketa-prozedura honek DNArentzat ezinbestekoak diren primerrak, lotu gabeko nukleotidoak, gatzak eta entzimak kentzen ditu. amplikifikazioa, baina ondorengo erreakzio askoren kutsatzailetzat hartzen dira1.
- PCR purifikatzeko hainbat metodo daude amplikonak, agarosa gelen, biraketa zutabeen, punta funtzionalen, digestio entzimatikoen eta ale magnetikoen erabilera barne. Ikuspegi bakoitzak behar espezifiko bat bete dezake (kostua, abiadura, kalitatea), baina ale magnetikoak normalean erabiltzen dira NGS aplikazioetarako, automatizaziorako errazagoak direlako eta erraz eskalagarriak direlako²,³. Illumina-k bereziki gomendatzen du Agencourt® erabiltzea. AMPure® XP PCR arazketa sistema Nextera® XT DNA Liburutegiaren Prestaketa lan-fluxuaren garbiketa-urratserako (2. irudia). NGS liburutegiaren prestaketa-lan-fluxu askok erabiltzen dute AMPureXP aleen garbiketa, Ion Torrent barne,
- Roche, KAPA, New England BioLabs eta TATAA.
- The AMPure XP PCR arazketa sistemak fase solidoko inmobilizazio itzulgarriko (SPRI) ale paramagnetikoak erabiltzen ditu buffer optimizatu batean, 100 bp baino handiagoak diren zatiak selektiboki lotzeko. Ondorengo garbiketa-urratsek nahi ez diren PCR osagaiak kentzen dituzte, azken eluzio-urrats batek PCR purifikatua eman aurretik. amplikoiak.
2. irudia
Illumina Nextera® XT DNA liburutegiaren prestaketa-lan-fluxua. Sampfitxategiak bide estandarraren bidez prozesatu ziren; tagmentazioa, ampargitzea, garbitu erabiliz AMPure® XP sistema, normalizazioa eta metaketa, sekuentziaziora igaro aurretik- Hemen deskribatutako metodo automatizatua erabili zen E. coli gDNA liburutegiak garbitzeko genoma osoaren sekuentziazioa egin aurretik. PIPETMAX 268 protokoloak ale magnetikoen bereizgailu pertsonalizatua erabili zuen (SPL-2294 pieza zenbakia), eta horri esker, erabiltzaileak 96 segundo arte prozesatu ditzake.ampexekuzio bakoitzeko (3. irudia).
- Imanezko aleen bereizgailu pertsonalizatuak (SPL-2294 pieza-zenbakia) 24 iman ditu, eta 96 putzuko plaka batekin kontaktu estuan egoteko igo edo jaitsi daitezke. Iman bakoitza lau putzuren artean kokatzen da, ale magnetikoak putzu bakoitzaren izkinara erakarriz.
MATERIALAK ETA METODOAK
Liburutegiaren Eraikuntza
- NGS liburutegiak E. coli K12 gDNAtik sortu ziren, Nextera® XT DNA Liburutegiaren Prestaketa erabiliz.
- Kit-a (Illumina pieza-zenbakia FC-131-1005) PIPETMAX 268-n fabrikatzailearen zehaztapenen arabera4. Hamabi primer multzo bakar erabili ziren gDNA prestatzeko.amples (1 ng 0.2 ng/uL-tan) jarraian tagmentazioa.
AMPure XP Protokolo Automatizatua
Balio lehenetsiak protokolo-aldagai guztietarako erabili ziren, Prozesatu beharreko Liburutegiko Putzuetarako izan ezik (4. irudia).
- Erabiltzaile interfazea aldagaiak aldatzeko, hala nola prozesatu beharreko liburutegiko putzuak, Samptransferentzia bolumena, AMPure® XP Beads-en transferentzia-bolumena, garbiketa-urratsak, etab.
- Laborategiko tresneria eta erreaktibo guztiak PIPETMAX 268 ohean jarri ziren probaren hasieran, puntak (DSF200ST, F172513 pieza-zenbakia), PCR plaka (Eppendorf pieza-zenbakia 0030 128.575) barne, putzu bakoitzak 50 µL zituela. ampeuskarri-oinarri batean dauden liburutegi aktibatuek (Applied Biosystems pieza-zenbakia N8010531), likido-biltegi batek (Seahorse pieza-zenbakia 201256-100) 2 ml-ko AMPure XP aleak (Beckman Coulter pieza-zenbakia A63881) eta 10 mL % 80ko etanol, 0.2 mL MikroAmp 8 hodiko tira (Applied Biosystems pieza-zenbakia N8010580) hodi bakoitzak 95 µL RSB birsuspentsio-bufferra duela, MIDI plaka huts bat (Thermo pieza-zenbakia AB-0859) ohean, eta beste bat ale magnetikoen bereizgailuan (SPL-2294J eta SPL-2294E pieza-zenbakiak) (5. irudia).
- PIPETMAX 268-n ohearen diseinurako erabiltzaile interfazea. Laborategiko materiala eta erreaktiboak ezkerretik eskuinera, atzetik aurrera: Punta Hondakinen Txorrota, DSF200ST Punta Rack, DSF200ST Punta Rack, RSB Bersuspentsio Bufferra 0.2 ml-ko 8 Hodi-zerrendetan, MIDI plaka hutsa azken eluzioko liburutegietarako, likido-biltegia duena... AMPure® XP aleak eta % 80ko etanola, hasierako materiala (ampLiburutegi hobetuak, DSF200ST punta-euskarria eta beste MIDI plaka huts bat bereizgailu magnetikoan garbiketa-prozedurarako.
- AMPure XP aleak (24 µL) aurrez nahastu eta MIDI plakaren hamabi putzuetara transferitu ziren ale magnetikoen bereizgailuan. Hamabiak ampliburutegi aktibatuak (40 µL) PIPETMAX 268 bidez MIDI plakara transferitu ziren. AMPXP aleak nahastu eta nahastu ziren. Ale-bereizle magnetikoa aktibatu zen, imanak MIDI plakarekin kontaktuan jarriz eta aleak behera tiratuz. Itxaronaldi labur baten ondoren,
Gainjarioa putzu bakoitzetik kendu eta baztertu egin zen. Ondoren, bi garbiketa egin zitzaizkien aleei, eta ondoren garbiketa-soluzioa (200 µL % 80ko etanola) gehitu eta hondakin gisa kendu zen. Aleei 15 minutuz airean lehortzen utzi zitzaien hondar-etanola kentzeko. Ale-bereizle magnetikoa deskonektatu zen, MIDI plakatik eremu magnetikoa kenduz, RSB (42 µL) liburutegi bakoitzari gehitu eta nahastu aurretik. Azkenik, Ale-bereizle magnetikoa aktibatu zen, imanak MIDI plakarekin kontaktuan jarriz eta aleak behera tiratuz, eta garbitutako liburutegiak MIDI plaka freskora eraman ziren.
Zatiaren tamainaren azterketa
PCR bidezko garbiketaren ondoren, DNA zatiaren tamaina ebaluatu zen.ampkalitatea eta koherentzia. Kantitate txiki bat (1 µL) bakoitzekoampTxip elektroforetiko batean kargatu eta Agilent 2100 Bioanalyzer batekin aztertu zen, elektroferograma arrasto bat sortuz zati bakoitzerako.ample.
EMAITZAK ETA EZTABAIDA
- Agencourt-a AMPure XP PCR arazketa sistema erabili zen E. coli K12 gDNA liburutegiak garbitzeko, Illumina Nextera® XT DNA liburutegia prestatzeko prozesuaren barruan.
- Protokoloa PIPETMAX 268an egin zen, ale magnetikoen bereizgailua erabiliz. Elektroferograma arrasto batek kalitate handiko s erakusten du.ampzatiak sortu ziren. Zati gehienak 700 eta 2000 base-pare artekoak ziren, kutsadurarik gabe (6. irudia).
- E. coli K12 gDNA zatien elektroferograma, Nextera® XT DNA Library Preparation Kit-arekin prozesatua eta -rekin garbitua AMPure® XP PCR arazketa sistema PIPETMAX 268an.
- PIPETMAX 268 gidoi automatizatua azkar eta erraz alda daiteke hainbat lan-fluxu eta aplikazio-beharretara egokitzeko, exekuzio-denbora aldagaiak doituz (1. taula). S-rako aldagaiakampSoluzio oso malgua eskaintzeko, prozesatu beharreko bolumenak, erreaktibo bakoitzerako bolumenak, garbiketa kopurua eta eluzio-bolumena sartzen dira.
1. taula
Agencourt®-erako PIPETMAX 268 Script automatizatuaren exekuzio-garaian doi daitezkeen aldagaiak AMPure® XP PCR arazketa sistema
| ALDAGAIA | UNITATEAK | LEHENESTASUNA | INFORMAZIOA |
| Liburutegiko putzuak prozesatu beharrekoak | N/A | A1:H12 | PCR erreakzioak garbitzeko erabili beharreko MIDI plakaren putzuak. |
| SampTransferentzia-bolumena (µL). | µL | 40 | Garbiketa-prozedurarako MIDI plakara transferitu beharreko PCR erreakzioaren bolumena. |
| AMPure® XP aleen transferentzia-bolumena | µL | 24 | MIDI plakara garbiketa-prozedurarako transferitzeko aleen bolumena. |
| Inkubazio Denbora | min. | 5 | S-ri uzteko denbora kopuruaampLesak eta aleak giro-tenperaturan inkubatzeko hasierako loturarako. |
| Garbiketa urratsak | N/A | 2 | PCR erreakzioak garbitzeko kopurua. |
| Garbiketa-transferentziaren bolumena | µL | 200 | Garbiketa-urrats bakoitzerako MIDI plakara transferitzeko garbiketa-disoluzioaren bolumena. |
| Airean lehortzeko denbora | min | 15 | S-ri uzteko denbora kopuruaampLeak eta aleak giro-tenperaturan inkubatzen utzi, gainerako etanola lurrundu dadin. |
| Erabiltzeko eluzio-buffer hodiak | N/A | 1:8 | Eluzio-bufferra duten hodiak. |
| Eluzio Buffer Transferentzia Bolumena | µL | 42 | Azken eluzio-urratserako MIDI plakara transferitzeko eluzio-bufferraren bolumena. |
| Liburutegia plaka berri batera eluitu | N/A | EGIA | Eluzio-bufferra gehitu ondoren, aukeran, Azken Eluzio-Bolumena plaka berri batera transferitu. |
| Azken Eluzio Transferentzia Bolumena | µL | 20 | Eluziotik ateratako s-ren bolumenaampprotokoloaren amaieran plaka berri batera mugitzeko. |
EGITEKO INFORMAZIOA
| ZATI ZENBAKIA | DESKRIBAPENA |
| 32100001 | PIPETMAX 268 estalki-ebakiekin |
| FC10021 | MAX8x200 Pipeta Burua |
| FC10022 | MAX8x20 Pipeta Burua |
| 32000091 | PIPETMAX 268 erretilua, 384 putzukoa. |
| 32000175 | PIPETMAX 268 punta egokitzaile blokeak (x 3) |
| 32000321 | TRILUTION® mikroa instalatuta |
| 32000177 | PIPETMAX 268rako punta biltegiratzeko euskarria |
| SPL-2294J-HDW | Ale magnetikoen bereizgailuaren euskarria |
| SPL-2294E-HDW | Ale magnetikoen bereizgailu imana |
| 40000026 | Eskuzko torlojua (x 6) |
| 32000292 | Berriro kargatu bloke-klipa (x 4) |
| 4214540393 | Garbigailua (x 4) |
| 32000303 | Mikroamp 96 PCR hodi-euskarri laburra |
| F172513 | DSF200ST Diamantezko puntak blister ontzian |
ONDORIOA
- E. coli K12 gDNA liburutegiak genoma osoaren sekuentziaziorako prestatu ziren Illumina Nextera XT DNA Liburutegiaren Prestaketa kitaren barruan.
- Agencourt-a AMPure XP PCR arazketa sistema normalean hurrengo belaunaldiko sekuentziazio lan-fluxuetan garbiketa-urratserako erabiltzen da.
- Aplikazio-ohar honek PIPETMAX 268 protokolo automatizatua erakusten du, ale-bereizle magnetikoa erabiltzen duena.
- Aldagaiek erabiltzaileari protokoloa exekuzio-garaian aldatzeko aukera ematen diote, prozedura aspergarri eta teknikoki erronkatsu baterako irtenbide dinamikoa sortuz.
ERREFERENTZIAK
- Agencourt® AMPure® XP Erabilerarako Informazio Gida, PCR Purifikazioa. PN B37419AA. AEB: 2013. Inprimatua.
- Head, S., Komori, HK, LaMere, SA, Whisenant, T., Van Nieuwerburgh, F., Salomon, DR eta Ordoukhanian, P. Liburutegiaren eraikuntza hurrengo belaunaldiko sekuentziaziorako: baino gehiagoviewak eta erronkak. BioTeknologiak., 56: 61-77 (2014).
- Bronner, IF, Quail, MA, Turner, DJ, Swerdlow, H. Illumina sekuentziaziorako protokolo hobetuak. Curr Protoc Hum Genet., 18.2, (2009).
- Nextera® XT DNA Liburutegiaren Prestaketa Erreferentzia Gida. 15031942 v01. San Diego, CA, AEB. 2016. Inprimatua.
Markak
Produktu eta enpresa izen guztiak dagozkien jabeen marka komertzialak™ edo marka erregistratuak® dira. Dokumentu honetan marka komertziala(k) erabiltzeak ez du esan nahi marka komertzialen jabearekin(ek) duten afiliaziorik edo babesik dagoenik.
Oharra
Aplikazio-ohar hau argitaratzeko unean eskuragarri zegoen informazioa erabiliz sortu eta editatu da. Aplikazio-ohar hau aldez aurretik jakinarazi gabe berrikusi daiteke.
ESKERRAK
Lan hau Gilson Applications taldeak (WI, AEB) eta Branedon Converse-k (Lucigen) egin zuten.
- WI, AEB.
- www.gilson.com/contactus
Ohiko galderak
Zein aplikazio egin daitezke PCR purifikatuarekin ondorengo moduan? amplikoiak?
PCR purifikatua ampLikonak ezinbestekoak dira Sanger eta hurrengo belaunaldiko sekuentziaziorako, genotipaziorako, klonaziorako, zatien analisirako eta primer ibilaldirako.
Zenbat sampZenbat fitxategi prozesatu daitezke exekuzio bakoitzeko ale magnetikoen bereizgailu pertsonalizatuarekin?
Bereizgailu magnetiko pertsonalizatuak 96 segundo arteko prozesamendua ahalbidetzen duamples exekuzio bakarrean.
Zein da erabiltzen den teknologia AMPure XP PCR purifikazio sistema?
Sistemak fase solidoko immobilizazio itzulgarriko (SPRI) ale paramagnetikoak erabiltzen ditu 100 bp baino handiagoak diren PCR zatiak selektiboki lotzeko.
Dokumentuak / Baliabideak
 |
GILSON PIPETMAX 268 Laborategiko Likidoen Manipulazio Plataforma Automatizatua [pdfArgibideak PIPETMAX 268 Laborategiko Likidoen Manipulazio Automatikoko Plataforma, PIPETMAX 268, Laborategiko Likidoen Manipulazio Automatikoko Plataforma, Likidoen Manipulazio Automatikoko Plataforma, Likidoen Manipulazio Plataforma, Manipulazio Plataforma |